诊断根据当地流行情况，有无百日咳患者接触史。若患儿曾有发热，但热退后咳嗽症状反而加重，特别在晚间咳嗽剧烈，且无明显肺部阳性体征，应作为疑似诊断。若有明显痉咳，外周血计数白细胞及淋巴细胞分类均明显增高则根据这些特点可作出百日咳临床诊断。加之细菌培养阳性或血清学免疫学、PCR检查阳性可以确诊百日咳。

下列疾病应与百日咳相鉴别。  

1.急性支气管炎和肺炎

由乙型流感杆菌、腺病毒、呼吸道合胞病毒、副流感病毒等引起的支气管炎，咳嗽较剧烈，常有痉咳。但剧烈咳嗽在起病数日内即出现，痉咳后无鸡鸣样回声，夜间不一定加重，急性期全身感染中毒症状如喘咳、气促较重，肺部常有固定的干湿音，白细胞计数正常或偏高。经适当治疗后，症状在短期内减轻或消失。  

2.支气管淋巴结结核

肿大的淋巴结压迫支气管，或侵蚀支气管壁，可引起痉挛性咳嗽，但无鸡鸣样回声。可根据结核病中毒症状、结核菌素试验、肺部X线改变等作出诊断。  

3.气管支气管异物

可突然发生阵发性痉咳，有异物吸入史，白细胞不增高，X线可见节段性肺不张，作支气管镜检查可发现异物。  

4.百日咳综合征

在普遍进行百日咳预防免疫的人群中，仍可有散发的“百日咳”病例出现。常分离出腺病毒、其他呼吸道病毒、肺炎支原体和副百日咳杆菌等，而无百日咳杆菌。其临床症状、肺部X线表现和血象所见，与典型百日咳有似之处，需靠病原学检查鉴别。据估计，约20%的病例系由上述病原所致。衣原体感染可有类似百日咳样咳嗽，但无鸡鸣样回声。副百日咳杆菌引起者症状轻，病程短。