SA-30诱导的小鼠子宫内诱导型一氧化氮合酶的变化
解剖学报 2000年第3期第31卷 短篇报道
作者：孙秉贵　周占祥　邓泽沛
单位：孙秉贵（中国农业大学动物医学院解剖学教研室，北京　100094）；周占祥（中国农业大学动物医学院解剖学教研室，北京　100094）；邓泽沛（中国农业大学动物医学院解剖学教研室，北京100094）
关键词：SA-30；诱导型一氧化氮合酶；免疫组织化学；子宫；小鼠
　　【摘要】　目的　检测精子膜抗原SA-30对小鼠子宫内诱导型一氧化氮合酶(iNOS)含量及分布的影响，从而了解SA-30的抗生育机制。　方法　SA-30免疫雌性昆明小鼠后，应用免疫组织化学方法，对子宫内的iNOS进行了检测。结果　SA-30免疫后对间情期小鼠子宫内的iNOS没有明显影响，无论是免疫组还是对照组，在子宫内膜基质中均有大量阳性细胞分布，两者无明显差异；在妊娠第3d时，对照组的小鼠子宫中有较多iNOS表达，阳性标记主要集中在内膜上皮及固有膜中的子宫腺上，经SA-30免疫的小鼠子宫中，iNOS表达则显著减少，整个内膜标记极弱，只在子宫肌层内有少量iNOS阳性细胞分布。　结论　SA-30可能通过使妊娠早期小鼠子宫内iNOS表达显著减少，而影响小鼠胚胎植入及早期胚胎的发育。
[-hzh-] 　　【中图分类号】　Q954.4　【文献标识码】　A　【文章编号】　0529-1356(2000)03-271
THE CHANGES OF iNOS IN MOUSE UTERUS INDUCED BY SA-30
SUN Bing-gui, ZHOU Zhan-xiang, DENG Ze-pei
　　(Department of Anatomy, College of Veterinary Medicine, China Agricultural University, Beijing 100094，China)
　　【Abstract】　Objective　To understand the antifertility mechanism of SA-30 by detecting the changes of iNOS in mouse uterus. Methods　After being immunized with SA-30, the iNOS in mouse uterus was detected by immunohistochemical methods.Results　In dioestrous mice, many iNOS⁺ cells were found in the stroma of endometrium. There was no obvious differences between the immunized mice and the control mice. In the uterus on 3 day of pregnancy, however, there was obvious difference about the iNOS quantity in uterus between the immunized and the control mice. There was strong positive reaction on the epithelia of endometrium and the endometrial gland in the lamina propria in control mice, while the staining of iNOS in the uterus of SA-30 immunized mice was very weak, only a few of iNOS⁺　cells were observed in the myometrium.Conclusions　SA-30 may impair the implantation and development of early mouse embryos by leading to the reduction of iNOS in uterus.
　　【Key words】　SA-30; iNOS; Immunohistochemistry; Uterus; Mouse
　　一氧化氮(nitric oxide,NO)是一种不稳定的气体自由基分子，已经证明它参与哺乳动物的多种生理活动，如平滑肌松弛、血管舒张、神经信号传递等。NO是在一氧化氮合酶(NOS)催化下，由L-精胺酸氧化而形成的。研究发现，哺乳动物多种组织内有NOS的分布，迄今为止分离到的NOS共有3种类型：Ⅰ型即神经型/脑型NOS(nNOS/bNOS)、Ⅱ型即诱导型NOS(iNOS)、和Ⅲ型即内皮型NOS(eNOS)。
　　近来，NO与生殖功能关系的研究受到了人们的重视，越来越多的证据表明，NO对生殖过程的许多环节有调节作用^［1］。免疫组织化学结果证实，在大鼠及人的睾丸、附睾和输精管上有iNOS广泛分布，人及小鼠精子表面也检测到了nNOS的存在，提示NOS/NO对精子的生成及成熟有影响。Herrero^［2］等的结果进一步证实，NOS/NO参与了小鼠精子的顶体反应，并且影响到其受精过程。对雌性生殖活动的研究表明，NOS/NO影响大鼠卵巢的排卵、早期胚胎的发育及胚胎的植入过程，而且NO的过度释放还是引起早期胚胎死亡的原因之一。免疫组织化学及RT-PCR的研究结果显示，妊娠小鼠和大鼠子宫中有eNOS、iNOS mRNA的存在及其蛋白的表达，但iNOS与妊娠的关系似乎更密切。
　　SA-30是从牛精子膜上分离到的一种可以和伴刀豆素A结合的糖蛋白^［3］，主要分布在精子的顶体区，而且在获能及顶体反应后不消失，并已经证明用它免疫小鼠可导致生育力下降。本实验应用免疫组织化学的方法，对SA-30免疫后的小鼠子宫内iNOS进行了检测，旨在探讨SA-30对子宫iNOS的影响，从而进一步了解其抗生育机制。
　　材料和方法
　　1.SA-30的提取
　　按文献［3］的方法进行。
　　2.免疫动物试验
　　成年昆明系小鼠(8～10周龄)购自中国科学院遗传研究所，常规饲养1周后挑选健康者进行实验。SA-30(30μg/只)用等体积的完全弗氏佐剂充分乳化，背部皮内多点注射(0.1ml/只)，3周后进行第1次加强免疫，剂量改为40μg/只，佐剂用不完全弗氏佐剂，免疫途径为腹腔注射(0.1ml/只)，以后每隔两周加强免疫1次，剂量与途径均与第1次加强免疫相同，共加强免疫4次。对照组小鼠用不加SA-30的佐剂免疫。
　　3.取材
　　小鼠最后1次加强免疫后第8d，按雌雄3∶1的比例合笼，第2d清晨检查有阴栓者定为妊娠0d，妊娠第3d时颈椎脱臼处死(共5只)，迅速取出子宫于未加冰醋酸的Bouin液中固定48h，梯度酒精脱水，二甲苯透明，Paraplast包埋，制备5μm厚切片。没有合笼的小鼠做阴道涂片确定发情周期，取间情期小鼠的子宫(共5只)，同上制备5μm厚切片。对照组小鼠和SA-30免疫组同时取材。
　　4.免疫组织化学染色
　　切片经二甲苯脱蜡、梯度酒精后入蒸馏水进行水化，再用PBS(0.01mol/l,pH7.4，下同)洗5min；0.3%H₂O₂(无水甲醇配制)室温封闭15min，PBS洗3×5min；10%正常羊血清封闭，37℃20min；兔抗小鼠iNOS多克隆抗体(中山公司，1：20稀释)于4℃孵育18h，PBS洗3×5min；生物素化的羊抗兔IgG(SIGMA,1：50稀释)于37℃孵育30min，PBS洗3×5min;Streptavidin-HRP(GIBCO Ltd.,1:100)于37℃孵育30min，PBS洗3×5min;DAB(SIGMA)显色，常规封片。
　　阴性对照用PBS代替第一抗体。
　　结果和讨论
　　本实验以免疫组织化学的方法，对SA-30诱导小鼠子宫内iNOS表达的变化进行了检测，结果表明，经SA-30免疫后的小鼠，在妊娠第3d时子宫内的iNOS表达比对照组小鼠(只用佐剂免疫)明显减少，只在肌层偶见少数几个阳性细胞(图2)，而对照组小鼠的子宫内膜上皮及子宫腺上皮中则有大量的iNOS分布(图1)。间情期时，SA-30免疫小鼠和对照小鼠子宫内iNOS的分布及阳性细胞数量无明显区别，均在内膜基质中有大量阳性细胞(图3，4)。这一结果提示，SA-30免疫后，主要是对妊娠期子宫内的iNOS表达产生影响，而对间情期则无明显作用。说明SA-30对小鼠子宫iNOS的影响具有时期依赖性。
　　间情期小鼠子宫内膜基质细胞上有iNOS抗体的阳性标记，提示这些细胞可以表达iNOS。研究表明，iNOS对机体抵抗外界病原感染有帮助^［4］，间情期子宫内的iNOS可能主要是起抗感染的作用，以保持子宫内环境的无菌状态。妊娠第3d的小鼠子宫中有大量iNOS表达，这与我们在另一项实验中得到的结果一致(待发表)。妊娠第3d正处于小鼠胚胎植入的前1d，此时子宫正在为迎接胚胎做着积极的准备，子宫中iNOS的表达可能对此具有重要意义。已有研究证实，NO可以激活GC而使细胞内cGMP含量升高，从而导致子宫肌层平滑肌和子宫内血管壁平滑肌松弛^［1］，一方面使血管舒张，血流量增大，从而有利于子宫内膜的蜕膜化过程，血管舒张对炎性细胞的渗入也有好处，而炎性细胞是发生蜕膜化所需要的^［5］。另外，NO作为一种舒张因子，它作用于子宫平滑肌可使子宫保持静息状态，有利于胚胎的发育和植入。NO含量的增加还可引起子宫内前列腺素(PG)的增多，而PG是促进子宫内膜蜕膜化的因素之一。事实上，前人已经在体内及体外实验中表明，NO/NOS系统是胚胎着床和早期胚胎发育的必要条件^［1］。Novaro等给大鼠子宫腔注射L-NAME(一种NOS的竞争性抑制剂)，发现胚胎着床数减少了50%。Gouge等用含有一种非特异性NOS抑制剂(N^G-nitro-L-arginine)的培养液对小鼠早期胚胎(妊娠1～4d)进行体外培养，发现胚胎的正常发育受到抑制。SA-30免疫后，子宫内iNOS表达显著减少，提示SA-30具有类iNOS抑制剂的功能。iNOS表达减少会引起NO的产量降低，从而可能影响小鼠胚胎的发育和着床，导致妊娠失败，这可能是用SA-30免疫小鼠后，引起抗生育作用的机制之一。



图版说明
　　图1　对照组妊娠第3d小鼠子宫内iNOS的免疫细胞化学定位。在子宫内膜上皮有iNOS强阳性反应，内膜固有层中的子宫腺上也有iNOS的中等阳性标记，e:子宫内膜；m:肌层；ul:子宫腔　×56
　　图2　SA-30免疫后妊娠第3d小鼠子宫内iNOS的免疫细胞化学定位。整个子宫内膜上iNOS反应极弱，只在子宫肌层偶见iNOS阳性细胞(右上角图×224)，e:子宫内膜；m:肌层；ul：子宫腔　×56
3　对照组间情期小鼠子宫内iNOS的免疫细胞化学定位。在子宫内膜基质中有大量iNOS阳性细胞分布，e:子宫内膜；m:肌层　a:×112;b:×224
4　SA-30免疫后间情期小鼠子宫内iNOS的免疫细胞化学定位。在子宫内膜基质中可见大量iNOS阳性细胞，e:子宫内膜；m:肌层　a:×112;b:×224
5　阴性对照。整个切片上均无阳性标记。e:子宫内膜　×112
Explanation of figures
　　Fig.1　The immunohistochemical staining of iNOS in control mouse uterus(3 day of pregnancy). There was strong positive reaction on the epithelium of endometrium, and moerate positive staining was found on the endometrial gland. e:endometrium; m:myometrium; ul:uterine lumen. ×56
　　Fig.2　The immunohistochemical staining of iNOS in mouse uterus (3 day of pregnancy) immunized with SA-30. There was no staining in the endometrium, only a few of iNOS positive cells were observed in the myometrium (the right upper×224).e:endometrium; m:myometrium; ul:uterine lumen. ×56
　　Fig.3　The immunohistochemical staining of iNOS in control mouse uterus(dioestrous). Many iNOS positive cells were observed in the stroma of endometrium. e:endometrium; m:myometrium. a,×112; b,×224
　　Fig.4　The immunohistochemical staining of iNOS in mouse uterus (dioestrous) immunized with SA-30. Many iNOS positive cells were observed in the stroma of endometrium. e:endometrium; m:myometrium. a,×112; b,224
　　Fig.5　Negative control. There was no positive staining on this section. e:endometrium. ×112
　　【基金项目】　国家自然科学基金资助项目(39770543)
　　【作者简介】　孙秉贵(1971—)，男，河北阜平人，硕士，助教
　　通讯作者(To whom correspondence should be addressed)
参考文献
　　［1］Rosselli M, Keller PJ, Dubey RK. Role of nitric oxide in the biology, physiology and pathophysiology of reproduction［J］. Hum Reprod Update,1998,4(1):3-24.
　　［2］Herrero MB.Viggiano JM,Martinez SP,et al.Effects of nitric oxide synthase inhibitors on the outcome of in vitro fertilization in the mouse［J］.Reprod Fertil Dev,1996,8(2):301-304.
　　［3］周占祥，孙秉贵，邓泽沛.牛精子膜SA-30在获能与顶体反应后的定位变化［J］.解剖学报，1998，29(2):178～183.
　　［4］Wei XQ, Charies IG, Smith A, et al. Altered immune responses in mice lacking inducible nitric oxide synthase［J］. Nature,1995,375(6530):408-411.
　　［5］Weitlauf HM. Biolgy of Implantation. In:Knobil E, Neill JD(eds). The Physiology of Reproduction［M］.2nd ed. New York:Raven Press,1994:391-439.
【收稿日期】1999-06-02　【修稿日期】1999-11-12