癌症的分子检测
　　Molecular assessment of Cancer Carlos Caldas
　　英国医学杂志中文版
　　cHINESE EDITION
　　1999年第1期No.1 1999
关键词：癌 分子标志 基因 检测
[-hzh-] 　　近20年来，对人类肿瘤基本生物学研究取得了可喜进展，近年来,癌症在英国已成为主要的致死原因。现已确认肿瘤的发生是由于体细胞中基因改变积累的结果。从唾液、痰、尿、粪便和血液样品中查找具有特异基因改变的细胞很可能成为常见癌症人群筛选的常规方法。基因检测也将用于肿瘤分期和检测微小转移。特异基因改变和临床结局的对照有助于更准确地确定预后，并使医生更有效地进行治疗。
　　癌是基因改变的疾病
　　肿瘤的发生是伴有体细胞中基因改变累积的多阶段的过程。这是癌生物学方面的主要发现。肿瘤经过癌前病变进展到明显的肿瘤，然后浸润、转移，这都是控制细胞增殖和死亡的基因突变后,获得选择性生长优势的体细胞一轮轮克隆性生长的结果¹。突变可以是促进细胞增殖或抑制细胞死亡的癌基因的激活，也可以是抑制肿瘤增殖或促进细胞死亡的肿瘤抑制基因的失活。一个正常细胞需要积累至少5或6项,这些突变才能成为癌细胞¹。
　　因为癌细胞的基因（染色体或DNA）内部不稳定，故在癌细胞中有较高的突变率。这种基因的不稳定性似乎是癌细胞的特性¹。
　　结直肠癌是人类癌症中基因改变研究的最好例证²。具有肿瘤抑制基因APC失活的正常粘膜细胞增生而形成小的腺瘤性息肉。接着可出现癌基因（如K-ras）和肿瘤抑制基因（p53和DCC）的突变，使息肉转变成大腺瘤，最终发展到癌。在整个进展过程中，结直肠癌均表现出基因的不稳定。在约15%的结直肠癌中，由于缺少DNA复制期间修复错配的能力，基因不稳定导致简单重复DNA核苷酸的细小序列改变（称为微卫星不稳定）²。在其余85%的病例中，则有明显的染色体改变。这可能是由于有丝分裂过程中染色体分离或重新结合的缺陷，或是分离和重新结合两者均有缺陷所致³。在大多数人类癌症中，虽不像结直肠癌中那样清楚，但相似的基因改变也有报道。

可能的临床前景 不久将在所有人类主要癌症中明确详细的基因改变和基因表达的改变形式 　　获得某一病人原发瘤的基因改变特点将成为决定预后和最佳治疗的常规 　　将利用非创伤性获得的临床标本(唾液、痰、尿、粪便、粘膜冲洗液)做分子检测， 　　进行大规模人群的癌的筛查 　　手术切缘、淋巴结和血液的分子检测将成为癌瘤分期的一部分常规 　　浸润前早期肿瘤和癌前病变的分子检测将使癌在出现症状前得到治愈

　　癌的分子标志：突变和基因不稳定
　　由于突变和基因不稳定是肿瘤发展的原因，故很容易理解为什么在细胞群体中检测突变或基因不稳定可能成为有用的诊断方法，甚至对预测预后也很有用。
　　可通过分析，从细胞分离的DNA或其染色体来检测基因改变。能使DNA扩增成百万倍的聚合酶链反应（PCR）使人们可用很少量的组织进行研究（图1a），分析DNA有无突变、缺失或微卫星不稳定。应用某一突变作为分子标志，不仅需要知道其基因的序列，也要知道其基因的特异改变（图1b）。在癌中确定基因序列的改变很困难且很费时间，不利于临床推广应用。
　　分析PCR扩增的DNA也可用于观察染色体是否有缺失（图1c）。这些缺失常发生在肿瘤抑制基因座位；也可用于检测微卫星不稳定，约20%人类癌症中有微卫星不稳定⁴。癌细胞中的微卫星改变或者缺失，或者不稳定都是有用的标志。因微卫星分析简单、快速、便宜，且其分析过程也很容易实现自动化。

微卫星 。为在同源染色体的特殊部位数量不等的核苷酸　的串联重复(常为CA*) 　　。随机分布于人类基因组中，其功能尚不清楚 　　。某一既定位点微卫星序列的总长，在个体中常为　杂合性，片段大小可用凝胶电泳分析(图1c和d) 　　* CA分别为胞嘧啶和腺嘌呤的缩写——译者注

　　一旦通过从原发瘤分离的DNA序列分析中检测到癌的特异性突变，那么这种突变可作为特异标志在病理或临床标本的成千上万个细胞中检测出少数的癌细胞。细胞遗传学的染色体分析可作为另一检测癌细胞基因突变的辅助方法。现代技术，尤其是荧光原位杂交技术比较简单而且重复性好，可用于观察染色体的大体改变，如异倍体、移位和缺失。
　　癌的早期诊断
　　以上描述的分子方法能检测源于很小病变中的异常细胞或脱落到临床标本中的少量癌细胞的突变基因。因这些检测既敏感又特异，故在早期诊断和检测癌复发上有巨大的潜在价值。
　　1991年，Sidransky等在膀胱癌病人的尿样本中检测到p53肿瘤抑制基因的突变，其结果与原发瘤中的突变一致（图2）⁵。Sidransky小组的研究表明，p53的突变在诊断膀胱癌前9年采集的尿样本中已可检测到⁶。在后来的研究中，20例诊断膀胱癌的病人中，19例尿沉渣中检测到与膀胱癌有关的微卫星改变，而尿细胞学在18例病人的尿样本中仅9例查到癌细胞⁷。这些结果表明膀胱癌的分子检测是一种比尿细胞学更为敏感的筛查方法。
　　同一研究组在可治愈的结直肠肿瘤病人的粪便中检测到K-ras癌基因的突变⁸。K-ras和p53基因突变不仅从癌症病人中，也可从以后患癌的人以及那些患癌高危人群的一些临床标本（尿、粪便、胰液、血、痰和唾液）中成功地检测出来，这表明分子检测方法在癌症的早期诊断中具有潜在的价值^9，10。
　　图2　病理标本或临床样本中癌特异突变的检测。从癌细胞中提取纯化DNA，序列分析，找出癌特异突变。构建放射性标记的含癌特异突变的探针。从腋窝淋巴结（乳腺癌）或尿沉渣（膀胱癌）提取DNA，经PCR扩增。DNA中有一小部分来自于微转移的癌细胞或脱落到尿内的癌细胞。将DNA转到膜上，用放射性标记的探针进行杂交以检测少数细胞中含有与肿瘤相同的突变
　　大规模筛查以发现非浸润性的癌前病变和早期癌已证明能有效地减少癌的患病率和死亡率。宫颈癌细胞学筛查和乳腺照相以发现乳腺癌都确实有效¹¹。然而，过度诊断和假阴性是主要问题，增加癌的分子检测方法作为宫颈涂片和乳腺癌高危妇女乳头吸液细胞学诊断的辅助方法将大大减少此问题。
　　在仔细设计的临床实验中，这些检测将明显提高敏感性和特异性。这些检测现正用于原发性和复发性膀胱癌（用尿沉渣）、头颈部癌（用唾液）和肺癌（用痰）的早期诊断。
　　人类癌症的分子分期
　　准确地评估癌局部区域的播散程度在预后和治疗上都非常重要。通常这种评估是基于肿瘤标本切缘和局部淋巴结的组织学检查。存在的问题是因取材不当或细胞形态学证据不足而漏掉很小的转移癌灶。肿瘤标本切缘和淋巴结的分子检测可改进分期的准确性。此外，检测外周血中循环的癌细胞使判断微转移和带瘤状态成为可能¹⁰。
　　新近研究的25例头颈部癌病人的组织切缘病理检查均为阴性而判定已完全切除，但其中一半至少在肿瘤标本一个切缘有与其原发瘤相同的p53突变¹²。这些病人比无基因突变者明显易于局部复发（5/13比0/12），判定这些病人中分子检测有效性的工作正在进行。同样，在结直肠癌病人也证明：在淋巴结中进行p53或K-ras突变的基因检测，在发现转移散布上，是比病理检查更为敏感的指标¹³。肾细胞癌病人的淋巴结组织中检测到单个肿瘤细胞的报道也表明染色体分析在分期中的潜在临床价值¹⁴。
　　预测预后和指导治疗的分子概况
　　通过检测某一癌症病人的基因概况（例如它可能表明对放疗敏感）和某种癌的基因改变情况，然后将这些改变与临床预后对照比较，最终将能改善我们预测预后的能力并更有效地选择治疗。我们需要更好的预后标志，尤其是对乳腺癌——在那些腋窝淋巴结没有转移的病人中，难以决定哪些病人需要辅助的化疗。
　　分子标志的价值由一份报告首先提出，该报告提出，乳腺癌病人中复发率增加和生存期缩短与HER-2/癌基因的扩增有关¹⁵。此后，总数近1000例乳腺癌病人的研究将原发癌中p53突变和预后直接对照，表明p53突变与预后不良密切相关。复发的相对危险率在2.2和4.7之间，死亡率在2.9和23.2之间¹⁶。如果能在大组前瞻性临床研究中证实的话，这些发现提示有p53突变的病人预后较差，可能需要更积极的或不同的治疗。
　　在结直肠癌中也有人进行了相似的研究。已发现结直肠肿瘤细胞中染色体的丢失，尤其是染色体17p和18q的缺失与预后差有关¹⁷。用PCR DNA扩增技术和微卫星分析以确定染色体18q的状态的方法，已成为一种实用的基因检测方法。用这种方法观察到，有18q等位基因缺失的Ⅱ期癌病人的预后与Ⅲ期癌病人相似¹⁸。提示这些病人应视为Ⅲ期，并给予辅助治疗。相反，没有18q等位基因缺失的Ⅱ期癌病人有一定的存活率，其总存活状况和无复发两者，都与Ⅰ期癌病人相似。
　　分子改变情况除影响是否给予辅助治疗的决定外，还影响治疗的选择。 例如，据报道称，乳腺癌病人中，p53突变与对doxorubicin的耐药性有关¹⁹。如果确实的话，提示在乳腺癌原发癌瘤中有p53突变的病人，应换掉此药。
　　结论
　　临床上从深入了解癌的基因发病机理所得到的益处可能很重要。单一癌的基因似不能用作通用的标志。但较好地勾画出常见肿瘤基因改变的特征，将有望提供一小组用于筛查和早期诊断大多数癌症的分子标志。单单实现这一可能，即将使癌的发生率和死亡率减少，因为很多肿瘤能在诊断时治愈。在不远的将来，其它可能的益处包括改进癌的分期、更准确地预测预后和决定采用更恰当的治疗。治好大多数人类癌症的最终目标尚不明朗，这需要更好地了解癌细胞中基因改变的生物学后果。
　　文后参考文献从略，编者承索提供或经BMJ网址(www.bmj.com)免费检索
　　BMJ 1998；316：1360-3
(陈杰译　丁濂校)